Projet

CREOLE

Etude du potentiel prédictif de biomarqueurs moléculaires

Période : 2011 - 2014 Budget Decod : 0 € Coordinateur : UMR ESE Contact: Virginie DUCROT Mots-clés : évaluation du risque environnemental, pesticides, perturbateurs endocriniens, mollusques, crustacés, criblage, transcriptomique, protéomique, reprotoxicité, critère d'exclusion

Recherches

Contexte et problématique

La directive EC 1107/2009 propose d'utiliser le potentiel perturbateur endocrinien (PE) sur la faune sauvage comme critère d'exclusion ("cut-off criterion") dans la réglementation des pesticides. La pertinence écotoxicologique de ce critère est cependant controversée et les outils de criblage nécessaires à son application chez les invertébrés n'existent pas encore. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des méthodes de criblage susceptibles de renseigner sur les mécanismes mis en jeu dans la réponse aux PE, et de relier la réponse de ces tests de criblage à l'observation d'effets sur les individus exposés aux toxiques in vivo lors de tests de reprotoxicité en laboratoire.

Objectifs

Dans ce contexte, le projet CREOLE vise à développer une méthode de criblage des PE chez les invertébrés, basée sur le couplage d'approches de transcriptomique et de protéomique associées à l'estimation des performances reproductives, déterminantes pour le maintien et l'évolution des populations. Cette méthode est développée en parallèle chez le gastéropode d'eau douce Lymnaea stagnalis et chez le crustacé copépode estuarien Eurytemora affinis. Elle est appliquée à un panel de pesticides/biocides considérés comme PE eut égard à leur mode d'action chez les vertébrés (action anti-androgénique : vinclozoline VZ, tributylétain TBT et action œstrogénique : éthynil-œstradiol EE2 chlordécone CLD) et chez les invertébrés (action mimétique d’hormones juvéniles : méthoprène MP et pyriproxyfène PXF). Ces produits sont étudiés seuls et en mélanges binaires. Ces substances sont utilisées seules ou en mélanges binaires, l'association étant basée à la fois sur les modes d’actions et les effets reprotoxiques. Les apports de ce projet à l’action publique seront d’une part la mise à disposition d'une méthode de criblage pour l'évaluation du risque des PE en vue de l'application de la directive EC 1107/2009, et d'autre part une contribution au débat scientifique sur la pertinence du critère PE comme "cut-off" environnemental dans la procédure réglementaire d'évaluation du risque écotoxicologique des pesticides.

Méthodologie

Le suivi de l'expression différentielle de gènes et de protéines impliqués dans le contrôle endocrinien permet de réaliser un criblage spécifique des propriétés PE des pesticides et biocides chez les deux espèces. Les patrons de réponses du transcriptome et du protéome associés aux PE sont comparés aux résultats des tests YES (Yeast Estrogen Screen) et YAS (Yeast Androgen Screen) [tests de criblage de l'affinité des produits aux récepteurs aux estrogènes et aux androgènes des vertébrés], afin de tester la fiabilité de ces tests in vitro non spécifiques quant à leur capacité de discriminer les effets propres aux PE chez des espèces "non standards". L'évaluation des effets reprotoxiques repose sur la mesure des performances reproductives (réponse intégrée, comprenant l'étude de la fécondité et de la viabilité/qualité de la descendance) lors de tests réalisés en laboratoire durant 28 jours chez chacune des deux espèces. Les réponses moléculaires sont enfin mises en relation entre elles et avec les performances reproductives, afin d'estimer dans quelle mesure l'induction de changements des fonctions sous contrôle hormonal conduit à la reprotoxicité.

Résultats

• La première phase du projet a permis de réaliser les tests in vitro YES et YAS, et d'élaborer les protocoles de bioessais in vivo pour les deux espèces. Ces protocoles décrivent (i) l'exposition semi-statique des animaux aux toxiques pendant 4 j (pour E. affinis) et 28 j (pour L. stagnalis), (ii) les méthodes d'échantillonnage et de préparation des tissus destinés aux études 'omics' et (iii) le suivi des performances reproductives des animaux exposés.
• Ces protocoles ont été mis en œuvre pour réaliser des bioessais les deux espèces, visant à mesurer les concentrations internes en toxique, les niveaux d’expression transcriptomique, les niveaux d’expression des protéines totales, et la fécondité. Ces bioessais sont actuellement encore en cours de réalisation pour certains produits chez E. affinis ; ils sont terminés pour L. stagnalis.
• L'analyse préliminaire de la fécondité des lymnées exposées a d'ores et déjà permis de mettre en évidence certains résultats intéressants. Le MP, le PXF, l'EE2 et la VZ n'ont pas d'effet sur la reproduction. En revanche, la CLD et le TBT ont engendré une diminution significative de la fécondité par rapport aux témoins. Les composés œstrogéniques (CLD) et anti-androgéniques (VZ) n'ont pas affecté la fécondité. Pour chacun des mélanges, les effets sont équivalents à ceux observés pour le composé le plus toxique présent dans le mélange: il n'y a pas eu d'antagonisme, d'additivité ou de synergie. Ces résultats montrent que les modes d'action supposés des composés (définis sur la base de leur affinité avec les récepteurs aux stéroïdes chez les vertébrés) ne sont probablement pas transposables à L. stagnalis et posent la question du mode d'action de ces PE chez cette espèce.
• Chez L. stagnalis, après contrôle de qualité des ARN extraits des tissus d'intérêt (système nerveux central et appareil reproducteur), les librairies d'ADNc ont été construites et séquencées pour l'analyse d'expression différentielle (RNAseq). Cette analyse est en cours.
• L'analyse du transcriptome pour E. affinis et à l'analyse du protéome sont en cours pour les deux espèces. Les données obtenues seront utilisées afin de faire le lien entre le mode d'action supposé des produits et mélanges étudiés (action (anti)œstrogénique ou (anti)androgénique, telles que déterminées sur la base des tests in vitro YES et YAS) et les effets in vivo mesurés à différentes échelles : transcription, expression protéique, et physiologie de la reproduction.

Publications issues du projet

Personnes impliquées

BESNARD Anne-Laure, Assistante-Ingénieure Téléphone : +33 2 23 48 54 43 Email : anne-laure.besnard(at)inrae.fr

COLLINET Marc, Technicien de recherche Téléphone : +33 2 23 48 55 29 Email : marc.collinet@inrae.fr

COUTELLEC Marie-Agnès, Chargée de recherche Téléphone : +33 2 23 48 52 48 Email : marie-agnes.coutellec@inrae.fr

DUCROT Virginie, Chargée de recherche Téléphone : +33 2 23 48 56 25 Email : virginie.ducrot@inrae.fr

ECHASSERIAU Yann, Ingénieur d'études Téléphone : +33 2 23 48 56 25 Email : yann.echasseriau@inrae.fr

LAGADIC Laurent, Directeur de recherche Téléphone : +33 2 23 48 52 37 Email : laurent.lagadic@inrae.fr

VASSAUX Danièle, Technicienne de recherche Téléphone : +33 2 23 48 56 69 Email : daniele.vassaux@inrae.fr

Partenaires

Financements

Ce projet est financé par le Programme Environnement-Santé-Travail de l'ANSES avec le soutien des ministères chargés de l’écologie et du travail (contrat N° EST-2011/1/190)